uutiset

Polymeraasiketjureaktio (PCR)

AP.BIO:

IST ‑ 1 (EU)

,

IST -1.P (LO)

,

IST ‑ 1.P.1 (EK)

Tekniikka, jota käytetään DNA: n tietyn kohdealueen monistamiseen tai monien kopioiden tekemiseen.

 

Avainkohdat:

  • Polymeraasiketjureaktiotai PCR, on tekniikka tehdä monia kopioita tietystä DNA -alueesta in vitro (koeputkessa kuin organismissa).
  • PCR perustuu lämpöstabiiliin DNA -polymeraasiin, Taq polymeraasija vaatii DNA: ta alukkeet suunniteltu erityisesti kiinnostavalle DNA -alueelle.
  • PCR: ssä reaktio kierretään toistuvasti sarjan lämpötilan muutosten läpi, mikä mahdollistaa useiden kohdealueen kopioiden tuottamisen.
  • PCR: llä on paljon tutkimusta ja käytännön sovelluksia. Sitä käytetään rutiininomaisesti DNA -kloonauksessa, lääketieteellisessä diagnostiikassa ja DNA: n rikosteknisessä analyysissä.

Mikä on PCR?

Polymeraasiketjureaktio (PCR) on yleinen laboratoriotekniikka, jota käytetään monien kopioiden (miljoonien tai miljardien!) tekemiseen tietystä DNA -alueesta. Tämä DNA -alue voi olla mikä tahansa, josta kokeilija on kiinnostunut. Se voi esimerkiksi olla geeni, jonka tehtävän tutkija haluaa ymmärtää, tai rikosteknisten tutkijoiden käyttämä geneettinen merkki, joka yhdistää rikospaikan DNA: n epäiltyihin.

Tyypillisesti PCR: n tavoitteena on saada riittävästi kohde -DNA -aluetta, jotta sitä voidaan analysoida tai käyttää jollakin muulla tavalla. Esimerkiksi PCR: llä monistettua DNA: ta voidaan lähettää jaksotus, visualisoinut geelielektroforeesitai kloonattu plasmidiin jatkokokeita varten.

PCR: ää käytetään monilla biologian ja lääketieteen aloilla, mukaan lukien molekyylibiologian tutkimus, lääketieteellinen diagnostiikka ja jopa jotkut ekologian alat.

Taq -polymeraasi

Kuten DNA kopiointi elimistössä PCR vaatii DNA -polymeraasientsyymin, joka luo uusia DNA -juosteita käyttäen nykyisiä juosteita templaateina. Tyypillisesti PCR: ssä käytettyä DNA -polymeraasia kutsutaan Taq polymeraasi, sen lämpöä sietävän bakteerin jälkeen, josta se eristettiin (Thermus aquaticus).

T. aquaticus asuu kuumissa lähteissä ja hydrotermisissä tuuletusaukoissa. Sen DNA-polymeraasi on erittäin lämmönkestävä ja aktiivisin noin 70 ° \ teksti C70 ° C70, °, aloitusteksti, C, lopusteksti (lämpötila, jossa ihminen tai E. coli DNA -polymeraasi ei toimisi). Tämä lämmönkestävyys tekee Taq-polymeraasista ihanteellisen PCR: lle. Kuten näemme, korkeaa lämpötilaa käytetään toistuvasti PCR: ssä denaturointi templaatin DNA: ta tai erottaa sen säikeet.

PCR -alukkeet

Kuten muutkin DNA -polymeraasit, Taq polymeraasi voi tuottaa DNA: ta vain, jos sille annetaan a pohjamaali, lyhyt nukleotidisekvenssi, joka tarjoaa lähtökohdan DNA -synteesille. PCR -reaktiossa kokeilija määrittää DNA -alueen, jonka valitsemat alukkeet kopioivat tai monistavat.

PCR-alukkeet ovat lyhyitä yksijuosteisen DNA: n paloja, yleensä noin 202020 nukleotidin pituisia. Jokaisessa PCR -reaktiossa käytetään kahta aluketta, ja ne on suunniteltu siten, että ne reunustavat kohdealuetta (alue, joka tulisi kopioida). Toisin sanoen heille annetaan sekvenssejä, jotka saavat ne sitoutumaan templaatti -DNA: n vastakkaisiin juosteisiin juuri kopioitavan alueen reunoilla. Alukkeet sitoutuvat malliin täydentävällä emäsparilla.

DNA -malli:

5 ′ TATCAGATCCATGGAGT… GAGTACTAGTCCTATGAGT 3 ′ 3 ′ ATAGTCTAGGTACCTCA… CTCATGATCAGGATACTCA 5 ′

Aluke 1: 5 ′ CAGATCCATGG 3 ′ Aluke 2:

Kun alukkeet on sidottu malliin, polymeraasi voi laajentaa niitä ja niiden välinen alue kopioidaan.

[Tarkempi kaavio, joka osoittaa DNA: n ja alukkeen suunnan]

PCR: n vaiheet

PCR -reaktion tärkeimmät ainesosat ovat Taq polymeraasi, alukkeet, templaatti -DNA ja nukleotidit (DNA -rakennuspalikat). Ainesosat kootaan putkeen yhdessä entsyymin tarvitsemien kofaktorien kanssa, ja ne suoritetaan toistuvilla lämmitys- ja jäähdytysjaksoilla, jotka mahdollistavat DNA: n syntetisoinnin.

Perusvaiheet ovat:

  1. Denaturointi (96 ° \ teksti C96 ° C96, °, aloitusteksti, C, lopputeksti): Kuumenna reaktio voimakkaasti erottaaksesi tai denaturoidaksesi DNA -juosteet. Tämä tarjoaa yksisäikeisen mallin seuraavaan vaiheeseen.
  2. Hehkutus (555555 - 656565 ° \ teksti C ° C °, aloitusteksti, C, lopullinen teksti): Jäähdytä reaktio niin, että alukkeet voivat sitoutua yksisäikeisen templaatin DNA: n komplementaarisiin sekvensseihin.
  3. Laajennus (72 ° \ teksti C72 ° C72, °, aloitusteksti, C, lopputeksti): Nosta reaktiolämpötiloja niin, Taq polymeraasi laajentaa alukkeita syntetisoimalla uusia DNA -juosteita.

Tämä sykli toistuu 252525 - 353535 kertaa tyypillisessä PCR -reaktiossa, joka kestää yleensä 222-444 tuntia kopioitavan DNA -alueen pituudesta riippuen. Jos reaktio on tehokas (toimii hyvin), kohdealue voi muuttua yhdestä tai muutamasta kopiosta miljardeihin.

Tämä johtuu siitä, että se ei ole vain alkuperäinen DNA, jota käytetään mallina joka kerta. Sen sijaan yhdellä kierroksella tehty uusi DNA voi toimia mallina seuraavalla DNA -synteesikierroksella. Alukkeista on monia kopioita ja monia molekyylejä Taq polymeraasi kelluu reaktiossa, joten DNA -molekyylien määrä voi karkeasti kaksinkertaistua jokaisella kierroskierroksella. Tämä eksponentiaalisen kasvun malli näkyy alla olevassa kuvassa.

Käyttämällä geelelektroforeesia PCR -tulosten visualisoimiseksi

PCR -reaktion tulokset visualisoidaan yleensä (tehdään näkyväksi) käyttämällä geelielektroforeesiGeelielektroforeesi on tekniikka, jossa DNA -fragmentit vedetään sähkövirralla geelimatriisin läpi ja se erottaa DNA -fragmentit koon mukaan. Standardi tai DNA -tikkaat ovat tyypillisesti mukana, jotta PCR -näytteen fragmenttien koko voidaan määrittää.

Saman pituiset DNA-fragmentit muodostavat geeliin "nauhan", joka voidaan nähdä silmällä, jos geeli värjätään DNA: ta sitovalla väriaineella. Esimerkiksi PCR -reaktio, joka tuottaa 400400400 emäsparin (bp) fragmentin, näyttäisi tältä geelillä:

Vasen kaista: DNA -tikkaat, joissa on 100, 200, 300, 400, 500 bp: n kaistat.

Oikea kaista: PCR -reaktion tulos, kaista 400 bp.

DNA -kaista sisältää monia, monia kopioita kohde -DNA -alueesta, ei vain yhtä tai muutamaa kopiota. Koska DNA on mikroskooppinen, siitä on oltava paljon kopioita, ennen kuin voimme nähdä sen silmällä. Tämä on suuri osa siitä, miksi PCR on tärkeä työkalu: se tuottaa tarpeeksi kopioita DNA -sekvenssistä, jonka voimme nähdä tai manipuloida kyseisellä DNA -alueella.

PCR -sovellukset

PCR: ää käyttämällä DNA -sekvenssi voidaan monistaa miljoonia tai miljardeja kertoja, jolloin saadaan tarpeeksi DNA -kopioita analysoitavaksi muilla tekniikoilla. Esimerkiksi DNA voidaan visualisoida geelelektroforeesilla, lähetettäväksi jaksotustai pilkottu restriktioentsyymeillä ja kloonattu plasmidiksi.

PCR: ää käytetään monissa tutkimuslaboratorioissa, ja sillä on myös käytännön sovelluksia oikeuslääketieteessä, geneettisessä testauksessa ja diagnostiikassa. Esimerkiksi PCR: ää käytetään monistamaan geenejä, jotka liittyvät geneettisiin häiriöihin potilaiden DNA: sta (tai sikiön DNA: sta, jos kyseessä on synnytystesti). PCR: ää voidaan käyttää myös bakteerin tai DNA -viruksen testaamiseen potilaan kehossa: jos taudinaiheuttaja on läsnä, voi olla mahdollista monistaa sen DNA -alueita verestä tai kudosnäytteestä.

Näyteongelma: PCR rikostekniikassa

Oletetaan, että työskentelet oikeuslääketieteellisessä laboratoriossa. Olet juuri saanut DNA -näytteen rikospaikalta jätetyistä hiuksista sekä kolmen mahdollisen epäillyn DNA -näytteet. Sinun tehtäväsi on tutkia tiettyä geneettistä merkkiainetta ja nähdä, vastaako jokin kolmesta epäillystä tämän DNA: n hiusten DNA: ta.

Merkkiä on kaksi alleelia tai versiota. Yksi sisältää yhden toiston (ruskea alue alla), kun taas toinen sisältää kaksi kopiota toistosta. PCR -reaktiossa alukkeilla, jotka reunustavat toistuvaa aluetta, ensimmäinen alleeli tuottaa 200200200 \ text {bp} bpstart text, b, p, end text text DNA fragment, but the second tuottaa 300300300 \ text {bp} bpstart text, b , p, lopputeksti DNA -fragmentti:

Markkerialleeli 1: toistuvan alueen reunustavat alukkeet monistavat 200 bp: n DNA -fragmentin

Markkerialleeli 2: toistuvan alueen reunustavat alukkeet monistavat 300 bp: n DNA -fragmentin

Suoritat PCR: n neljälle DNA -näytteelle ja visualisoit tulokset geelelektroforeesilla, kuten alla on esitetty:

Geelissä on viisi kaistaa:

Ensimmäinen kaista: DNA -tikkaat, joissa on 100, 200, 300, 400 ja 500 bp: n kaistat.

Toinen kaista: DNA rikospaikalta, 200 bp: n kaista.

Kolmas kaista: epäilty #1 DNA, 300 bp: n kaista.

Neljäs kaista: Epäilty nro 2 DNA, 200 ja 300 bp: n kaistat.

Viides kaista: Epäilty #3 DNA, 200 bp: n kaista.

Kenen epäillyn DNA vastaa rikospaikan DNA: ta tämän merkin kohdalla?

Valitse 1 vastaus:

Valitse 1 vastaus:

(Vaihtoehto A)

A

Epäilty 111

(Vaihtoehto B)

B

Epäilty 222

(Vaihtoehto C)

C

Epäilty 333

(Vaihtoehto D)

D

Kukaan epäillyistä

[Vihje]

Emme voineet arvioida vastaustasi. Näyttää siltä, ​​että jätit jotain tyhjäksi tai annoit virheellisen vastauksen.

Tarkistaa

Lisätietoja PCR: stä ja oikeuslääketieteestä

Todellisissa rikospaikan DNA -rikosteknisissä testeissä teknikot tekisivät samankaltaisen analyysin kuin edellä olevassa esimerkissä. Rikospaikan DNA: ta ja epäillyn DNA: ta verrattaisiin kuitenkin useita erilaisia ​​merkkejä (ei vain yksittäistä merkkiä esimerkissä).

Myös tyypillisessä oikeuslääketieteellisessä analyysissä käytetyt markkerit eivät ole vain kahdessa eri muodossa. Sen sijaan ne ovat korkealla polymorfinen (poly = monta, morph = lomake). Toisin sanoen niitä on monissa alleeleissa, jotka vaihtelevat pieninä pituuden lisäyksinä.

Oikeuslääketieteen yleisimmin käytetty markkerityyppi, ns lyhyet tandem -toistot (STR: t), koostuvat monista toistuvista kopioista samasta lyhyestä nukleotidisekvenssistä (tyypillisesti 222–555 nukleotidia pitkä). Yhdellä STR -alleelilla voi olla 202020 toistoa, kun taas toisella voi olla 181818 ja toisella vain 101010^11alun yläindeksi, 1, yläindeksi.

Tutkimalla useita markkereita, joista jokainen on monissa alleelimuodoissa, oikeuslääketieteen tutkijat voivat rakentaa ainutlaatuisen geneettisen "sormenjäljen" DNA -näytteestä. Tyypillisessä STR -analyysissä, jossa käytetään 131313 -merkkiainetta, väärän positiivisen (kaksi ihmistä, joilla on sama DNA -sormenjälki) todennäköisyys on pienempi kuin 111 101010 \ text {miljardia} miljardia aloitustekstiä, b, i, l, l, i, o, n, lopetusteksti^11alkoi yläindeksi, 1, lopeta yläindeksi!

Vaikka saatamme ajatella, että DNA -todisteita käytetään rikollisten tuomitsemiseen, niillä on ollut ratkaiseva rooli vapauttaessaan väärin syytetyt ihmiset (mukaan lukien jotkut, jotka olivat olleet vankilassa useita vuosia). Rikosteknistä analyysiä käytetään myös isyyden määrittämiseen ja ihmisen jäännösten tunnistamiseen katastrofikohtauksista.

[Nimeä ja viitteet]

Oletko opiskelija vai opettaja?

Opettajaopiskelija

 


Viestin aika: tammi-08-2021